D-氨基酸是許多生物活性分子重要的手性結構單元，廣泛應用於(yu) 製藥、化妝品、食品和農(nong) 用化學品行業(ye) 中。目前，合成D-氨基酸的生物催化方法較多，其中，利用D-氨基酸脫氫酶對α-酮酸進行還原胺化的方法具有較高的原子經濟性和理論產(chan) 率。然而天然的D-氨基酸脫氫酶十分稀少，而且主要以膜蛋白的形式存在，難以實現工業(ye) 化生產(chan) 。

內(nei) 消旋-二氨基庚二酸脫氫酶(meso-diaminopimelatedehydrogenase,meso-DAPDH)是一種對α-酮酸的還原胺化反應具催化活性的D-氨基酸脫氫酶，具體(ti) 反應路線如圖1所示。

圖1.meso-DAPDH催化α-酮酸的還原胺化反應

本文利用來自嗜熱芽孢杆菌（Bacillusthermozeamaize）中的Ⅱ型內(nei) 消旋-二氨基庚二酸脫氫酶（BtDAPDH）作為(wei) 模型，通過對其由內(nei) 向外的分級改造，以提高酶催化α-酮酸不對稱合成D-氨基酸的活性。

具體(ti) 研究過程如下：

（1）BtDAPDH的分級改造及動力學特性研究

將底物和輔酶NADPH對接到BtDAPDH的活性中心，根據底物苯甲酰甲酸的羰基碳和底物結合口袋區域的氨基酸Cα之間的距離，可將BtDAPDH的分為(wei) 3層，選擇用於(yu) 誘變的氨基酸殘基（共43個(ge) 殘基）展示如圖2。

圖2.BtDAPDH不同層中選定突變的氨基酸

對第一、二層選擇的位點分別用不同於(yu) 該位點的其餘(yu) 19個(ge) 氨基酸進行替換，並對好的單點突變體(ti) 進行組合，從(cong) 而獲得較優(you) 突變體(ti) M4（W129T/D134C/F154V/H235I）；繼續以M4為(wei) 出發模板，對第三層的26個(ge) 候選位點進行飽和突變，經過篩選獲得最優(you) 的突變體(ti) M5（W129T/D134C/F154V/S177A/H235I）。M5的催化活性比野生型酶提高了275倍（如圖3），對100mM底物的轉化率高達86%，且M5的動力學參數kcat/Km是野生型酶的125倍，熱穩定性也有所提高。

圖3.BtDAPDH突變體(ti) 相對於(yu) 野生型

(WT)的突變位點及相對活性

（2）BtDAPDH野生型酶(WT)及其突變體(ti) M5的底物譜研究

本文探究了BtDAPDH野生型酶和最佳突變體(ti) M5的底物範圍（如圖4）。研究表明，突變體(ti) M5對芳香族和脂肪族的α-酮酸都具有優(you) 異的催化活性和立體(ti) 選擇性，ee值均能達到99%。

圖4.BtDAPDH野生型酶(WT)及其突變體(ti) M5的底物譜

（3）突變體(ti) M5性能改變的機理研究

為(wei) 了解釋突變體(ti) M5催化活性和穩定性提高的機製，分別將底物苯甲酰甲酸對接到M5和NADPH、WT與(yu) NADPH的複合晶體(ti) 結構中（如圖5），再進行MD模擬。結果顯示，與(yu) 野生型相比，突變體(ti) M5在亞(ya) 胺中間體(ti) 形成中表現出更近的距離（d2:4.7Åvs10.0Å）和親(qin) 核攻擊（d1:3.9Åvs8.9Å），這些都有利於(yu) 催化效率的提升。

突變體(ti) M5中F154V和H235I的突變，導致非極性氨基酸殘基的疏水側(ce) 鏈緊密相鄰，形成疏水核心區域，促進底物的結合；且H162可以與(yu) 底物形成π−π堆積相互作用，從(cong) 而促進亞(ya) 胺中間體(ti) 的形成。這些構象調整有助於(yu) 保持催化口袋的穩定性，防止結構衝(chong) 突。

圖5.底物苯甲酰甲酸分別與(yu) WT和NADPH（左）、M5和NADPH（右）的複合晶體(ti) 結構

（4）突變體(ti) M5的反應條件優(you) 化

本文作者以苯甲酰甲酸為(wei) 底物，對反應溫度、pH、胺濃度、NADP+濃度等影響因素進行優(you) 化。由於(yu) 甲酸脫氫酶(BstFDH)與(yu) DAPDH酶的偶聯可有助於(yu) 反應中NADPH輔因子的再生，會(hui) 影響反應。因此，本文同時也對M5與(yu) BstFDH的投料比例進行了優(you) 化。

在5mL體(ti) 係中，采用補料分批方式，最佳反應條件為(wei) ：溫度30℃，pH10，1M甲酸胺，0.2mM的NADP+，M5和BstFDH的比例為(wei) 1:12，反應24h後轉化率高達99.5%。

（5）突變體(ti) M5的應用

本文將得到的BtDAPDH最佳突變體(ti) M5應用於(yu) 合成左旋苯甘氨酸、苯丙氨酸和D-苯基丁氨酸（克級規模），產(chan) 率均大於(yu) 80%，ee值均大於(yu) 99%（如圖6）。

圖6.利用BtDAPDH突變體(ti) M的應用案例

本文總結：本文通過對酶進行分級工程改造，擴大了底物與(yu) 酶的結合口袋，最終獲得了具有高催化活性的最佳突變體(ti) BtDAPDH-M5。M5同時還具有良好的熱穩定性和立體(ti) 選擇性，可有效催化大體(ti) 積脂肪族和芳香族類的α-酮酸進行的不對稱還原胺化反應。

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